（一）適用范圍

本操作說明適用于PBMC、CD3、CD4、CD8、CD19、NK等凍存細胞的復蘇操作過程。

（二）主要試劑

復蘇培養(yǎng)基：含有20%滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，復蘇1管細胞用量為30mL。

注：10%-20%滅活FBS均可，推薦20%滅活FBS。

IMDM，DMEM，MEM培養(yǎng)基均可，推薦RPMI-1640培養(yǎng)基。

（三）儀器設備

恒溫水浴鍋、生物安全柜（超凈工作臺）、離心機。

注：如無恒溫水浴鍋，用溫度37±3℃溫水亦可。

（四）復蘇操作流程

打開恒溫水浴鍋，水溫設置為37℃。

將復蘇培養(yǎng)基孵育至37℃，在生物安全柜內(nèi)，取9 mL復蘇培養(yǎng)基15 mL離心管。

從液氮罐或超低溫冰箱取出凍存管，用鉗子夾住凍存管蓋子邊緣，迅速放入37°C水浴中均勻快速的水平搖晃（勿將管蓋浸入水中），直至凍存管中冰晶完全融解，停止水浴（約90s-120s，確定完全融解后再進行轉(zhuǎn)移）。

用75%酒精擦拭凍存管表面以及蓋子，在生物安全柜內(nèi)打開凍存管，并把凍存管內(nèi)溶液用移液器轉(zhuǎn)移到裝有9 mL復蘇培養(yǎng)基的15 mL離心管內(nèi)（轉(zhuǎn)移時吸取和打出液體要輕柔緩慢，15s均勻吸取/打出1mL細胞懸液）。

吸取1 mL復蘇培養(yǎng)基洗滌凍存管，再將洗滌液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，按以上步驟重復洗滌凍存管一次。輕輕吹打5-7次混勻細胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。

離心后，棄上清，加入復蘇培養(yǎng)基至10mL，輕輕吹打重懸細胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。

離心后，棄上清，吸去殘留液體，加入復蘇培養(yǎng)基（根據(jù)計數(shù)需要計算加入復蘇培養(yǎng)基的體積，如用血球計數(shù)板進行計數(shù)，推薦重懸濃度5-10M/mL），輕輕吹打重懸細胞，避免氣泡。

對重懸均勻的細胞懸液進行數(shù)量和活率測定。

（五）復蘇注意事項

為避免細胞損失太大，復蘇過程盡可能使用15mL離心管。

如果儲存凍存細胞的設備距離水浴較遠，應用干冰進行轉(zhuǎn)移，避免凍存細胞在室溫中暴露太久。

融解搖晃過程中，不可將凍存管管蓋浸入水中，以免水進入管中，造成污染。

水浴后不可顛倒或傾斜凍存管，以免造成細胞損失。

細胞水浴過程操作要穩(wěn)定快速，轉(zhuǎn)移細胞到離心管以及吹打時操作要輕柔緩慢，切勿快速吹打剛剛復蘇的細胞。

減少棄上清后的液體殘留，以保證計數(shù)的準確性，但去上清時不可吸到管底細胞。

復蘇后細胞會在一個小時左右恢復到最佳狀態(tài)，如需對細胞進行損傷性處理，請等待細胞活性達到最佳后進行。

如需將細胞放置較長時間才能進行實驗，則加入復蘇培養(yǎng)基至10mL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置或搖床上震蕩。

應按本說明進行復蘇操作，且復蘇操作過程不能有時間停頓，以保證細胞活性。